Injection de peptides auto-assemblés et de cellules précurseurs neurales pour la réparation de la moelle épinière dans un modèle de rat

Résumé

Source : Zweckberger, K., et al. Utilisation synergique de cellules précurseurs neurales et de peptides auto-assemblés dans les lésions expérimentales de la moelle épinière cervicale. J. Vis. Exp. (2015).

Ce protocole démontre une approche d’injection ciblée pour la réparation des lésions de la moelle épinière dans un modèle de rat. Il s’agit d’administrer des peptides auto-assemblés (SAP) dans le noyau de la lésion pour créer un échafaudage de soutien, suivi d’injections de cellules précurseurs neurales (NPC) autour de la lésion pour remodeler le tissu.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Avant

1. la chirurgie, autoclavez les instruments et maintenez-les stériles pendant toute la durée de l’intervention chirurgicale en les plongeant dans un bain d’alcool à 70 %.
2. Anesthésie les rats Wistar (250-270 g) avec une combinaison d’oxygène (O₂), de protoxyde d’azote (N₂O) (1:1) et de 1,8-2,2 % d’isoflurane et favorise la respiration spontanée à l’aide d’un masque d’anesthésie gazeuse. Pour l’induction de l’anesthésie, commencez par 5 % d’isoflurane pendant 1 minute et réduisez ensuite. Avant de commencer la chirurgie, contrôlez la profondeur de l’anesthésie en administrant un stimulus douloureux (par exemple, au niveau des pattes). Appliquez des pommades grasses dans les yeux pour éviter la sécheresse et pour prévenir les infections ultérieures.
3. Placez les rats sur un coussin chauffant (37 °C) et fixez la tête dans un cadre stéréotaxique.
4. Rasez la région chirurgicale autour de la colonne cervicale et désinfectez-la avec de la povidone iodée et de l’alcool à 70 %.
5. Faites une incision médiane au-dessus de la colonne vertébrale à partir de la vertèbre cervicale (C2) pour atteindre le processus proéminent du corps vertébral thoracique 2 (T2).
6. Coupez la couche externe des muscles vertébraux directement sur la ligne médiane (pour éviter les saignements) dans une direction cranio-caudale et disséquez davantage les couches musculaires plus profondes sans ménagement jusqu’à ce que vous atteigniez le processus épineux et les lames. Insérez les enrouleurs.
7. Orientez le processus épineux proéminent du corps vertébral T2 pour observer les niveaux ciblés pour la laminectomie. Après l’identification et la préparation microchirurgicale des lames sélectionnées, coupez à travers les ligamenti flavae pour détacher les lames et le processus épineux. Enfin, coupez les lames à l’aide d’un coupe-os latéral à la moelle épinière et retirez-les doucement, en évitant toute compression de la moelle épinière elle-même.
   REMARQUE : Les niveaux les plus courants sont C5/6, C6/7 ou C7/T1. Le taux de mortalité périopératoire augmente au fur et à mesure que le niveau de lésion est rostral. Les saignements du sinus veineux paravertébral sont fréquents et peuvent être traités par une compression soigneuse avec une éponge.
8. Avant d’insérer le clip pour traumatiser le cordon, identifiez les racines nerveuses émergentes pour les épargner du clipsage (notamment aux niveaux C5/6).
9. Afin d’assurer une induction en douceur du clip, détachez la dure-mère ventrale de la face dorsale des corps vertébraux à l’aide d’un crochet et préparez un couloir pour le clip.
10. Enfin, insérez le clip ouvert et laissez-le se refermer (fermeture rapide) pour obtenir une contusion. La force de fermeture du clip et la durée de la fermeture du clip déterminent l’intensité du traumatisme et l’étendue de la compression. On utilise couramment des forces de coupe comprises entre 15 et 35 g et une durée de coupe de, par exemple, 1 minute (Figure 1).
11. Après avoir retiré le clip, adaptez les muscles en 2 couches et fermez la plaie.
12. Arrêtez l’anesthésie et laissez l’animal se réveiller sous votre observation continue jusqu’à ce qu’il retrouve une conscience suffisante pour le décubitus sternal. Enfin, mettez le rat dans une seule cage et suivez les directives de traitement postopératoire.
13. Étant donné que les animaux luttent contre la gravité de ce type de blessure, vous devez porter une attention particulière aux traitements postopératoires :
    1. Administrer des analgésiques (buprénorphine et méloxicam pendant 3 jours et 5 jours, respectivement, et en fonction des symptômes cliniques).
    2. Administrer une solution saline supplémentaire par voie sous-cutanée pendant 3 jours (2 fois par jour, 5-10 millilitres (ml)).
    3. Donnez des antibiotiques dans l’eau potable 2 jours avant et jusqu’à 7 jours après la chirurgie (par exemple, Moxifloxacine)
    4. Pressez la vessie 2 à 3 fois par jour jusqu’à ce que la récupération de la fonction vésicale soit constamment apparente.
    5. Observer les déficits neurologiques et l’état physiologique des animaux opérés au moins une fois par jour.

2. Injection de PAS et de NPC (14 jours après la blessure)

1. Induisez l’anesthésie décrite aux points 1.1 à 1.3, fixez la tête du rat dans un cadre stéréotaxique, retirez les points de suture ou les pinces de la plaie et désinfectez la plaie et la zone chirurgicale avec de la povidone iodée et de l’alcool à 70 %.
2. Disséquez soigneusement les muscles paravertébraux, insérez des écarteurs, retirez le tissu cicatriciel au microscope de la dure-mère et réexposez le site de la lésion.
3. Préparez des SAP à une concentration de 1 % (p/v) pour réaliser un gel de matrice extracellulaire. Les SAP QL6 ont un pH physiologiquement compatible et n’ont pas besoin d’être tamponnés avant l’injection. Pour visualiser les PAS dans la moelle épinière, utilisez un dérivé fluorescent de QL6 (QL6-isothiocyanate de fluorescéine [FITC]).
4. Injectez des SAP (5 microlitres (μl) au centre de la lésion, répartis en 2 portions, chacune de 2,5 μl bilatéralement de la ligne médiane. Utilisez une seringue Hamilton reliée au cadre stéréotaxique par un microcapillaire en verre (diamètre extérieur de 100 micromètres (μm)). Ouvrez la dure-mère avec précaution avec la pointe d’une aiguille pointue et insérez le capillaire en verre stéréotaxiquement de 2 millimètres (mm) dans la moelle épinière traumatisée.
5. Après avoir injecté 1/3 du volume, retirez l’aiguille à 1,5 mm de profondeur, puis 1/3 à 1 mm supplémentaire. Après l’injection de tout le volume, et avant de retirer la seringue, attendre 5 minutes pour stabiliser la formation du gel.
6. Pour générer des NPC, utilisez des souris adultes à protéine fluorescente rouge discosoma (DsRed) (ou des souris positives à la protéine fluorescente jaune [YFP], vertes) et isolez-les et cultivez-les à partir de la zone paraventriculaire.
7. Évaluer la viabilité des NPC par coloration au bleu trypan, qui indique la présence de ~90 % de cellules vivantes dans la suspension cellulaire. Diluez les cellules dans un milieu de croissance (50 x 10³ cellules vivantes/μl), puis utilisez-les pour la transplantation cellulaire.
8. Effectuer quatre injections intraspinales de 2 μl (volume total de 8 μl, contenant 4 x 10⁵ NPC) bilatérales à 2 mm rostral et caudal du site de la lésion. Après avoir ouvert la dure-mère, insérez le capillaire en micro-verre Hamilton à 1,5 mm sous la surface dorsale de la moelle épinière et injectez 2 μl de suspension cellulaire. Choisissez un débit d’injection d’environ 0,5 μl/min (min).
9. À la fin de chaque injection et avant de retirer le capillaire du cordon, attendez au moins 1 min, en laissant l’étirement des tissus s’adapter au nouveau volume cellulaire. (Graphique 2)

Résultats

Figure 1 : Modèle d’anévrisme de contusion/compression de clip. (A) Photographie au microscope chirurgical après laminectomie de C7/T1 et contusion/compression de la moelle épinière d’un rat. (B) Ph...

Matériaux